Cercetătorii olandezi combină CRISPR și bioluminiscența într-un test experimental pentruboli infecțioase

O proteină nocturnă nou dezvoltată ar putea accelera și simplifica diagnosticarea bolilor virale, potrivit cercetătorilor din Țările de Jos.
Studiul lor, publicat miercuri în Publicațiile ACS, descrie o metodă sensibilă, într-un singur pas, pentru analizarea rapidă a acizilor nucleici virali și a aspectului lor, folosind proteine ​​strălucitoare albastre sau verzi.
Identificarea agenților patogeni prin detectarea amprentelor lor de acid nucleic este o strategie cheie în diagnosticarea clinică, cercetarea biomedicală și monitorizarea siguranței alimentare și a mediului.Testele cantitative de reacție în lanț a polimerazei (PCR) utilizate pe scară largă sunt extrem de sensibile, dar necesită pregătirea sofisticată a probelor sau interpretarea rezultatelor, făcându-le impracticabile pentru anumite setări de asistență medicală sau setări cu resurse limitate.
Acest grup din Țările de Jos este rezultatul unei colaborări între oameni de știință din universități și spitale pentru a dezvolta o metodă rapidă, portabilă și ușor de utilizat de diagnosticare a acidului nucleic, care poate fi aplicată într-o varietate de situații.
Ei au fost inspirați de fulgerări de licurici, străluciri de licurici și stele minuscule ale fitoplanctonului acvatic, toate alimentate de un fenomen numit bioluminiscență.Acest efect de strălucire în întuneric este cauzat de o reacție chimică care implică proteina luciferază.Oamenii de știință au încorporat proteine ​​​​luciferazei în senzori care emit lumină pentru a facilita observarea atunci când găsesc o țintă.Deși acest lucru face ca acești senzori să fie ideali pentru detectarea la punctul de îngrijire, în prezent le lipsește sensibilitatea ridicată necesară pentru testele de diagnosticare clinică.În timp ce metoda de editare a genelor CRISPR poate oferi această capacitate, necesită mulți pași și echipamente specializate suplimentare pentru a detecta semnalul slab care poate fi prezent în probe complexe și zgomotoase.
Cercetătorii au găsit o modalitate de a combina o proteină legată de CRISPR cu un semnal bioluminiscent care poate fi detectat cu o simplă cameră digitală.Pentru a se asigura că există suficientă probă de ARN sau ADN pentru analiză, cercetătorii au efectuat amplificarea recombinazei polimerazei (RPA), o tehnică simplă care funcționează la o temperatură constantă de aproximativ 100°F.Ei au dezvoltat o nouă platformă numită Senzorul de acid nucleic luminescent (LUNAS), în care cele două proteine ​​CRISPR/Cas9 sunt specifice pentru diferite porțiuni adiacente ale genomului viral, fiecare cu un fragment de luciferază unic atașat mai sus.
Când genomul viral specific pe care cercetătorii îl examinează este prezent, două proteine ​​CRISPR/Cas9 se leagă de secvența de acid nucleic țintă;acestea devin în imediata apropiere, permițând proteinei luciferazei intacte să se formeze și să emită lumină albastră în prezența unui substrat chimic..Pentru a ține seama de substratul consumat în acest proces, cercetătorii au folosit o reacție de control care a emis lumină verde.Un tub care își schimbă culoarea de la verde la albastru indică un rezultat pozitiv.
Cercetătorii și-au testat platforma prin dezvoltarea testului RPA-LUNAS, care detecteazăARN SARS-CoV-2fără izolare obositoare a ARN și și-a demonstrat performanța de diagnosticare pe probe de tampon nazofaringian dinCOVID 19pacientii.RPA-LUNAS a detectat cu succes SARS-CoV-2 în 20 de minute în probe cu o încărcătură virală ARN de până la 200 de copii/μL.
Cercetătorii cred că testul lor poate detecta ușor și eficient mulți alți viruși.„RPA-LUNAS este atractiv pentru testarea bolilor infecțioase la punctul de îngrijire”, au scris ei.